1era parte: http://plin9k.ucoz.com/index/0-5

El fenómeno de heterotranscripción

Doce bases parecen ser el mínimo común denominador para que el ligando palindrómico EcoRI sea capaz de producir heterotranscritos artificiales como los aquí reportados presentes en el Genbank.

Los flancos palindrómicos más comunes para el oligo ccgaattcgg son g y c, produciendo el oligonucleótido gccgaattcggc. Menos frecuentes son los flancos c y g para producir el segundo oligonucleótido cccgaattcggg, que posee un efecto similar de heterotranscripción. Ésta última secuencia palindrómica es la que tenemos en la referencia (1). La misma secuencia palindrómica se encuentra en el ejemplo 9 del Cuadro 2 (Homo sapiens X93499 para la proteína RAB7), en la que nos encontramos con fragmentos de más de dos genes unidos en la misma hebra, mediante los ligadores palindrómicos ccccgaattcgggg y gcccgaattcgggc (12).

Cuadro 2. RNAs con porciones del ligador relacionado con EcoRI y algunas de sus citas.

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Clave/Organismo

Gene/Proteína *

Linker **

Citas ***

Homo sapiens

Miembro de la familia de genes 

Hs-cul-4A

Homo sapiens

PSCRIRHE

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 

99, 16899-16903. 2002.

AF176705                

Homo sapiens

Proteína F-box FBX10 (PINX1) 

[R: vector]

cctcgtgccgaattc

PRAEF

Curr. Biol. 9, 1180-2. 1999.

5

6

Notas: Aquí se presenta al ligador del tipo EcoRI ctcgtgccgaattcggcacgag como aparece en el Genbank para algunos genes humanos. Para ver el resto de este Cuadro 2 y la presencia del linker en otros organismos, acuda al URL: http://www.geocities.com/plin9k/t2.htm

*  Gene/Proteína (Símbolo del Gene) [notas para los flancos del linker (L or R)]

** Linker y su Traducción a Amino Ácidos según el Genbank

*** Referencias Correspondientes de acuerdo con el Genbank.

Abundancia de secuencias que incluyen el linker palindrómico del tipo EcoRI

Existen miles de secuencias que incluyen a las secuencias incompletas expresadas (expressed sequence tags, est) en el Genbank y en otras bases de datos de nucleótidos que aún contienen artefactos artificiales que presentan como común denominador a los linkers palindrómicos EcoRI semejantes a aquellos que aquí se describen.

Los linkers palindrómicos pudieran presentarse en tándems, en mitades, o con diferentes longitudes; siendo de 12 a 24 bases el rango más común. Los linkers artificiales se han reportado aún dentro de múltiples regiones codificantes, tales como los ejemplos que se presentan en el Cuadro 2 expandido (7). Éstos linkers también se reportan frecuentemente fuera de la región codificante, como por ejemplo en sus promotores:

1-) NR_001557 del H. sapiens aldehído oxidasa 2 (AOH2) en el cromosoma 2, oligo gaattcggcacgagc (13).

2-) NM_002342 H. sapiens receptor beta de linfotoxina (LTBR; miembro 3 de la superfamilia TNFR), oligo gctcgtgccgaattc (14).

Además, dichos linkers palindrómicos también han sido encontrados en la región 5’, v.gr., en la secuencia U43527 del supresor de metástasis del melanoma maligno KiSS-1, oligo (ctct)¹⁵cctcgtgccgaattcggcacgag (15), y/o en la región 3’, v.gr., en la secuencia AY029161 para la proteína X1 que interactúa con Pin2, oligo ctcgtgccgaattcggcac (16).

De los pocos envíos al Genbank que explícitamente reportan la presencia del adaptador EcoRI, Hirama et al (17) se destaca, junto con Inoue et al (18) y Savas et al (19). Sin embargo, Inoue et al (18) consideran solamente a las 8 bases iniciales del flanco izquierdo como si fueran parte del adaptor EcoRI. El efecto del linker palindrómico para la secuencia de Inoue pudiera extenderse al menos por unas 16 bases (secuencia D83948 para la proteína S1-1, oligo ggcacgagctcgtgccg) mediante un aparente fenómeno de auto-recombinación y auto-inserción en las interacciones hospedero-vector.

Una situación similar a aquella que observamos en Inoue se presenta en Savas et al (19), quien menciona en su envío al Genbank únicamente a las primeras 6 bases como si fueran parte del adaptor EcoRI (que pasa igual con la referencia 1, pero no con su secuencia enviada, L21934). En la referencia (19) de Savas et al, el efecto del tipo linker pudiera extenderse por unas 20 bases (secuencia X78445 para el citocromo P450 Cyp1-b-1, oligo gaattcggcacgaactcgtgc).

Hirama et al (17) es el único que menciona una extensión mayor para el adaptor de EcoRI, reportando que ésta se extiende por 14 bases (secuencia X56703 para la cadena rearreglada alfa del receptor de células T, oligo gaattcggcacgagct).

Quimeras ligadas por el palíndromo tipo EcoRI parecen resistir a su digestión enzimática

Los linkers palindrómicos persisten en las secuencias sin haber sido digeridos por sus enzimas. El descubrimiento de los mecanismos precisos de resistencia a la digestión enzimática se encuentra en espera de adicionales estudios. Sin embargo, es evidente que los más comunes linkers palindrómicos corresponden a la secuencia del adaptor de EcoRI gaattcggcacgag, que se usa para el sitio 5’UTR, y que ha sido reportada en algunas instancias al Genbank, v.gr., dentro de la secuencia AI607511, ctcgtgccgaattcggcacgag (similar a fosfoproteína acídica ribosomal PO). En dicha secuencia, se indica el uso del vector pBluescript SK(-), así como de EcoRI, con el uso adicional del vector Uni-ZAP XR. Dichas metodologías, así como aquellas descritas en (1, 5, 6), pudieran promover el fenómeno de ligamiento artificial abundante en el Genbank.

Figura 3. La auto-hibridización del ligador palindrómico del tipo EcoRI pareciera bloquear la digestión enzimática. Fenómeno también observado como si fuera un 'cierre de pantalón' a ambos extremos de largas secuencias, en donde dos partes distantes del ligador se aproximan y se pegan produciendo una forma tipo plásmido. [Ejemplos 38-42, Cuadro 2 expandido (7). Ésta figura se obtuvo usando el software de la referencia 20.]