Palindromati

 

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Biotecnólogo Independiente.

RESUMEN

 

Este artículo describe a una familia de heterotrancritos artificiales (quimeras de RNA), miles de secuencias en el Genbank que contienen fragmentos o al adaptador del tipo EcoRI ctcgtgccgaattcggcacgag actuando como enlazador palindrómico, el cual une a dos o más genes producto de differentes cromosomas. Esto sucede debido a que las metodologías actuales producen dichas secuencias que se encuentran en el Genbank, así como en los microarreglos de Affymetrix, y en muchos artículos publicados que reportan o que usan dichas secuencias portadoras del ligador del tipo EcoRI dentro de sus regiones codficantes, y/o de sus sitios mRNA 5’UTR ó 3’UTRs. Este ligando del tipo EcoRI y sus heterotranscritos son considerados aquí como artefactos experimentales, caracterización que pudiera ayudar a prevenir errores tanto en los estudios de mecanismos moleculares así como en el descubrimiento de productos farmacéuticos.

 

Palabras Clave: EcoRI, Palíndroma, Perilipina, Genbank, Affymetrix, microarreglo (microarray), especies-específico.

 

INTRODUCCIÓN

 

Es vital en el descubrimiento de nuevos tratamientos médicos el enfocarse en moléculas específicas sin efectos colaterales en otros tejidos. Para lograr dicho objetivo es necesario un estricto control de calidad dentro de las bases de datos moleculares. Este artículo describe el hallazgo de numerosos artefactos metodológicos reportados al Genbank. Se recomienda el más detallado análisis de secuencias de ácidos nucleicos para nuevos descubrimientos biológicos, médicos y farmacéuticos.

 

Un único RNA atando en su sola hebra a dos diferentes genes procedentes de dos diferentes cromosomas humanos (1) fue el principio teorético para mi estudio de heterotranscritos.

 

Aquí defino heterotranscritos como quimeras, secuencias compuestas de fragmentos correspondientes a dos o más genes procedentes del uno o de dos o más cromosomas.

 

Consideré que dicho fenómeno reportado en referencia (1) debería de ser reflejado en una racional y lógica combinación de productos genéticos Inteligentemente Diseñados (2, 3). Ya que la mayoría de las moléculas y de las rutas biológicas vitales se encuentran presentes en muchos organismos, inicialmente pensé que el fenómeno descrito en la referencia (1) tal vez estuviera presente en muchas secuencias naturales como posible común denominador funcional.

 

Inicialmente supuse que el estudio de secuencias similares o relacionadas con la presentada en la referencia (1), quizás pudiera ser útil en nuestro entendimiento de las bases moleculares de la variabilidad biológica.

 

Así, éste fenómeno se perfilaba como posible explicación para la abundancia de proteínas que excede el número de sus genes, debido a múltiples combinaciones modulares entre sus diversos mRNAs. Recientes estimados para humanos consideran que existen más de un millón de proteínas producidas por solamente unos 20,000 ó 25,000 genes (4).

 

Con dichas consideraciones en mente, mi idea inicial fue que, si la referencia (1) estaba en lo correcto, entonces la producción de numerosas proteínas podría haber experimentado un putativo proceso de hetero-ensamblaje de RNA al momento de su formación.

 

Sin embargo, después de cinco años de comparar secuencias, he llegado a percibir que esas hetero-secuencias que usan a un mismo oligonucleótido como su ligador común, son únicamente artefactos metodológicos.

 

El elemento común de éstas quimaeras es el ligador (el "linker”) ccgaattcgg (que se presentó en referencia 1 dentro de la secuencia L21934 para la enzima ACAT-1 del H. sapiens). Esto hace que las referencias 1, 5 y 6 (si describieran a un fenómeno real), se refieran a un evento especies-específico único para los seres humanos (2, 3).

 

Otro artículo con la misma secuencia (1) ha sido publicado recientemente por ese mismo grupo (5). Sus autores mencionaron desde la referencia (1) la similitud de ese ligador con el adaptador mas uado de EcoRI (herramienta extensamente usada en investigación en biología molecular), así de que la puerta sigue abierta para verificar si éste es un artefacto metodológico o no (5).

 

La construcción inicial de esa secuencia demostró que su librería de cDNA fue transformada en E. coli (cepa MC1061) usando el vector fagémido pBluescript, así como el vector de expresión pcDNA. Después, de nuevo lo retransformaron en la misma cepa de E. coli (6). Sin embargo, recientemente he visto que el uso de vectores similares pudiera estar involucrado en la producción de artefactos quiméricos en múltiples instancias, como en los ejemplos presentados en los Cuadros 1 y 2 (7).

 

Una posible, aunque remota, explicación para la referencia (1) es que allí estamos tratando con un proceso natural, exclusivamente restringido a los seres humanos. Así de que, cualesquiera que sea el veredicto final, el hecho es que el ligador o adaptor del tipo EcoRI descrito en (1) fue el punto inicial para los siguientes hallazgos que se describen en éste artículo.

 

Mi hipótesis personal es que los heterotranscritos o quimeras que incluyen al ligador palindrómico del tipo EcoRI ctcgtgccgaattcggcacgag o sus secuencias relacionadas, que se extienden al menos por unas doce bases, son artefactos artificiales debidos a las metodologías moleculares usadas, evento mediado principalmente por la interacción vector-hospedador.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

El hallazgo de un palíndroma similar en los microarreglos (microarrays) de Affymetrix

 

Las bases para este artículo aparecieron mientras trabajaba con los microarreglos. Estaba yo estudiando los cambios en la expresión genética en los ratones resistentes a la obesidad con la perilipina inactivada, "knock-out” (8, 11), mediante el uso de los DNA-Chips de Affymetrix, MG-U74A-v2 y usando el software gratuito educacional dChip V.1.2 (9). Entonces un particularmente intrigante hetero-transcrito se presentó, la secuencia nucleotídica AB030505, inicialmente reportada por sus remitentes como si fuera el mRNA del Mus musculus para UBE-1c1, UBE-1c2 y UBE-1c3 (cds completos). A continuación se describe la secuencia AB030505 y su elemento común, el ligador del tipo EcoRI, presente en miles de secuencias del Genbank.

 

Un cuidadoso estudio de la secuencia de nucleótído AB030505 usando Blast (10) me dirigió hacia un elemento que estaba ligando a dos largas secciones de dos diferentes genes en un RNA:

 

1. La secuencia de nucleótido AK078792 del cromosoma 10, codificando para un homólogo de la proteína mutada ubicua de melanoma (Mum1) y

2. La secuencia de nucleótido BC036273 del cromosoma 12, que codifica para la retinol deshidrogenasa 11 (similar al Arsdr1).

 

El elemento de enlace dentro de la secuencia AB030505 resultó ser el palíndroma ctcgtgccgaattcggcacgag, compuesto por 22 nucleótidos.

 

Aquí también, así como en el reporte inicial (1), dos transcritos originados en dos diferentes cromosomas aparecieron pegados en una sola hebra de mRNA. 22 bases centrales conteniendo al ligador, el palíndroma ccgaattcgg, similar al inicialmente reportado por la referencia (1).

 

Una secuencia palindrómica para la doble hélice de DNA posee los mismos nucleótidos si se lee en la dirección de 5’ a 3’, que es la dirección normal de lectura, ya sea desde la hebra plus (+) o la hebra minus (-). Una evaluación manual y visual de éste ligador palindrómico se llevó a cabo. Sorprendentemente, éste ligador se encontró presente en miles de secuencias reportadas al Genbank.

 

El Cuadro 2 expandido (7) presenta numerosos ejemplos del palíndromo (o secuencias relacionadas) que han sido reportados por sus remitentes como si se encontrara dentro de las regiones codificantes. El ligador palindrómico es frecuentemente traducido como el péptido artificial RAEFGT, ausente en las bases de datos de secuencias de proteínas (10).

 

Incremento en el número de secuencias palindrómicas reportadas al Genbank

 

Un incremento mensual ha sido observado en el número de secuencias que contienen al ligador del tipo EcoRI o sus derivados dentro de miles de secuencias. En un ejemplo reciente (14 Oct. 2005) efectuado en Blastn (alineamiento nucleótido - nucleótido), seleccionando la base de datos para las secuencias de ácidos nucleicos no redundantes (nr) del Genbank, una consulta de 44 letras palindrómicas se usó:

 

CTCGTGCCGAATTCGGCACGAGCTCGTGCCGAATTCGGCACGAG

 

Con esta secuencia obtuve 6010 Blast Hits usando las siguientes condiciones:

 

1. 10⁶ fue el número mínimo esperado. Algunos de esos resultados se presentan en el Cuadro 2 (7).

2. 1000 fue el número de descripciones y de alineamientos.

 

En la base de datos alterna del Genbank conteniendo secuencias incompletas expresadas (expressed sequence tags, est), que son mRNAs de posibles proteínas, el número de secuencias conteniendo al adaptador palindrómico EcoRI se cuenta también en los miles.

 

Palíndromas adicionales encontrados mediante el uso de microarreglos

 

Secuencias adicionales pertenecientes a éstos ligandos también se encontraron mediante el estudio de los resultados de microarreglos disponibles en el Internet usando la mencionada herramienta de software dChip (9) junto a la base de datos de las secuencias usadas por Affymetrix. En e1 Cuadro 1 se dan ejemplos conteniendo a los ligadores palindrómicos.

 

Affymetrix ha sido una exitosa metodología de microarreglos, para evaluar por ejemplo la expresión genética en humanos, en ratones y ratas. Sin embargo, tanto la presencia de los heterotranscritos artificiales y/o de sus ligadores artificiales pudiera conducir a una  representación errónea de su expresión genética dentro de los tejidos, ya que el área bajo la curva se reduce dramáticamente para esas secuencias genéticas.

 

Cuadro 1. El ligador del tipo EcoRI se encuentra presente tanto en secuencias del Genbank así como en los microarreglos de Affymetrix para humanos, ratones y ratas.

 

 

Clave/Organismo	EcoRI Affymetrix Sondas del Genbank [DNA Chip]	Gráfica con la no expresión del ligador tipo EcoRI	Cita
AB002533_at   Homo sapiens	Gaattcggcacgagcacgcgtgaga, Ggcacgagcacgcgtgagacttctc     [en los DNA Chips Humanos HuGene-FL y Hu6800]	Proteína Ribosomal LP2 (Qip1)	Shipp et al, Nature Med. 8, 68. 2002
AJ243503   (99534_at)   Mus musculus	Ttcggcacgagctcgtgccggtcct     [en los DNA Chips del Ratón MG-U74Av2 y MG-U74A]	Adipocito Ghrelina	Castro-Chavez et al. Diabetes 52, 2666. 2003
AI045710   (rc_AI045710_at)   Rattus norvegicus	Atgatatgtacagatccctcgtgcc, tgatatgtacagatccctcgtgccg, tatgtacagatccctcgtgccgcct, tgtacagatccctcgtgccgcctcg, gtacagatccctcgtgccgcctcgt     [en el DNA Chip de la Rata RG-U34B}	Disúlfidoo isomerasa, prot. relacionada (Erp70)	Children's National Medical Center

Nota: El palindróma ctcgtgccgaattcggcacgag del tipo EcoRI causa la caída en la expresión genética registrada por el microarray, demostrando su ausencia en los organismos [dChip V.1.2 (9)]. En la seguna columna se resaltan en azul claro las porciones correspondientes al linker palindrómico; en azul obscuro, los nucleótidos que son reemplazados para obtener el segundo set de sondas en "mismatch" para los DNA-Chips de Affymetrix.